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A New Next-Generation Sequencing–Based Method for Assessment of IGHV Gene Mutational Status in Chronic Lymphoid Leukemia

Mis en ligne : le 03 mars 2023

Mise au point d’un protocole (NextCLL) permettant l’analyse du statut mutationnel IGHV par NGS et applicable sur tout type de séquenceur.

La détermination du statut mutationnel du gène IGHV constitue l’un des piliers de la décision thérapeutique pour les patients atteints de leucémie lymphoïde chronique (LLC), les patients dont les gènes IGHV sont non mutés (>98% d’identité par rapport à la séquence germinale) étant à risque de progression plus rapide, contre-indiquant l’utilisation d’une immunochimiothérapie de type FCR en première intention. Cependant, la détermination du réarrangement des gènes d’Ig et leur statut mutationnel restent techniquement difficiles avec les techniques classiques de biologie moléculaire, avec un taux d’échec d’environ 10-20%. De plus, ces techniques identifient le clone dominant mais ne fournissent pas d’indication sur la diversité intra-clonale. Des kits commerciaux permettant la détermination du statut mutationnel IGHV par NGS ont également des contraintes technologiques freinant leur utilisation (coût et nécessité d’un séquençage en 2×300 bp sur séquenceur de type MiSeq).
Nous avons mis au point un protocole (NextCLL) permettant l’analyse du statut mutationnel IGHV par NGS et applicable sur tout type de séquenceur. Cette technique repose sur la réalisation de 4 PCR multiplex réalisées en parallèle utilisant les amorces recommandées par le consortium BIOMED2 (FR1, FR2, JHcons pour les différentes familles de gènes IGHV) ainsi que des amorces leaders. Les amplicons sont ensuite poolés, barcodés et séquencés sur NextSeq500 (2×150 bp). La reconstruction bio-informatique des séquences est réalisée avec les outils BBtools et BBmerge, puis les séquences sont analysées grâce à la plateforme bioinformatique Vidjil. Les performances techniques de NextCLL ont été comparées à celle de la technique classique (PCR et séquençage Sanger) pour 80 patients au diagnostic de LLC, montrant la supériorité de cette technique NGS (absence d’échec et séquençage depuis la séquence leader).

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